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Molecular Biotechnology
 
October 18 - 22
Coordinators: Paula Veríssimo and Carlos Faro

Corpo Docente:
Euclides Pires
Carlos Faro
Paula Veríssimo
Sandra Ribeiro
Isaura Simões
Pedro Castanheira
Lab. Biotecnologia Molecular do CNC
Dep. Bioquímica, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade de Coimbra
Programa Teórico
  • Clonagem de cDNA
  • Expressão heteróloga
  • Purificação de proteínas
  • Engenharia de proteínas
Programa Prático
  • Purificação e caracterização de proteínas nativas. Análise da expressão em diferentes órgãos
  • Mutagénese dirigida e expressão heteróloga de proteínas fundidas com GST
  • Mutagénese dirigida e expressão, purificação e caracterização de proteínas recombinantes
Programa Teórico-Prático 
  • Pesquisas em bases de dados na Internet
Programa de Trabalhos
 
Segunda
Terça
Quarta
Quinta
Sexta
9-10
--------
Aula 3
Aula 5
Aula 7
Apresentação
e discussão
resultados
10-11
     Aula 1
Lab.
Lab.
Lab.
11-12
Lab
Lab.
Lab.
Lab.
12-13
Lab
Lab.
Lab.
Lab.
 
 
 
 
 
 
 
14-15
Aula 2
Aula 4
Aula 6
Aula 8
Apresentação
e discussão
de resultados
15-16
Lab.
Lab.
Lab.
Lab.
16-17
Lab.
Lab.
Lab.
Lab.
17-18
Lab.
Lab.
Lab.
Lab.
 

 

Aula Teóricas
Segunda-feira,18 de Outubro
    • Aula 1: Estratégias de clonagem
    • Aula 2: Expressão heteróloga
Terça-feira, 19 de Outubro
    • Aula 3: Expressão heteróloga I
    • Aula 4: Estratégias de purificação de proteínas
Quarta-feira, 20 de Outubro
    • Aula 5: Estratégias de purificação de proteínas II
    • Aula 6: Purificação de proteínas recombinantes
Quinta-feira, 21 de Outubro
    • Aula 7: Engenharia de Proteínas I
    • Aula 8: Engenharia de Proteínas II
Mutagénese dirigida e expressão de proteína recombinante fundida com GST


Trabalho 1 – Mutagénese dirigida
Ø       Mutagénese dirigida por PCR
Ø       Digestão do plasmídeo mutado com Dpn I
Ø       Transformação das células competentes de E.coli estirpe TOP10F’
Ø       Isolamento de plasmídeos (mini-prep)
Ø       Análise de restrição
 Trabalho 2 – Expressão da proteina fundida com GST
Ø       Crescimento de células de E.coli estirpe BL21 transformadas com o plasmídeo pGST-PSI
Ø       Indução da expressão com IPTG
Ø       Centrifugação da cultura e lise das células
Ø       Purificação da proteína por cromatografia de afinidade Glutationa-Sepharose
Ø       Análise do processo de purificação por SDS-PAGE e por western blotting

 

Mutagénese dirigida e expressão, purificação e caracterização de proteínas recombinantes  


Trabalho 1 – Mutagénese dirigida  
Ø       Mutagénese dirigida por PCR
Ø       Digestão do plasmídeo mutado com Dpn I
Ø       Transformação das células competentes de E.coli estirpe TOP10F’
Ø       Isolamento de plasmídeos (mini-prep)
Ø       Análise de restrição
Trabalho 2 –Expressão, purificação e caracterização de cardosina A recombinante
Ø       Crescimento de células de E.coli estirpe BL21 transformadas com o plasmídeo pET23-cardA
Ø       Indução da expressão com IPTG
Ø       Centrifugação da cultura e lise das células
Ø       Isolamento dos corpos de inclusão
Ø       Solubilização da proteína e indução da estrutura tridimensional
Ø       Purificação da proteína recombinante
Ø       Análise do processo de purificação por SDS-PAGE e por western blotting
Ø       Ensaio da actividade enzimática


Purificação e caracterização de proteínas nativas
Análise da expressão em diferentes orgão
s

 

Trabalho 1- Purificação e caracterização de cardosinas, proteases aspárticas de Cynara cardunculus L.
Ø       Homogeneização de pistilos de Cynara cardunculus L. com tampão de extracção.
Ø       Centrifugação do extracto total e recolha do sobrenadante
Ø       Purificação das cardosinas
Ø       Análise do processo de purificação por SDS-PAGE
Ø       Caracterização da actividade enzimática
Trabalho 2- Análise da expressão das cardosinas em diferentes orgãos
Ø Expressão da cardosina A em diferentes orgãos da planta de Cynara cardunculus L.
Ø Homogeneização de sementes, raízes e folhas de Cynara cardunculus L. com tampão de extracção.
Ø Centrifugação do extracto total e recolha do sobrenadante
Ø Identificação da cardosina A por imunodetecção com anticorpo policlonal mono-específico      
Ø Expressão do mRNA da cardosina A em diferentes orgãos da planta de Cynara cardunculus L.
Ø RT-PCR

 

Artigos
Egas et al (2000) The Saposin-like Domain of the Plant Aspartic Proteinase Precursor Is a Potent Inducer of Vesicle Leakage. JBC 275, 38190–38196.  Pdf
Faro et al (1999) Cloning and Characterization of cDNA Encoding Cardosin A, an RGD-containing Plant Aspartic Proteinase. JBC 274, 28724–28729.  Pdf
Frazão et al (1999) Crystal Structure of Cardosin A, a Glycosylated and Arg-Gly-Asp- containing Aspartic Proteinase from the Flowers of Cynara cardunculus L. JBC 274, 27694–27701.   Pdf
Ramalho-Santos et al (1997) Cardosin A, an abundant aspartic proteinase, accumulates in protein storage vacuoles in the stigmatic papillae of Cynara cardunculus L. Planta 203, 204-212.   Pdf
Simões & Faro (2004) Structure and function of plant aspartic proteinases. Eur. J. Biochem. 271, 2067–2075.  Pdf
Veríssimo et al (1996) Purification, characterization and partial amino acid sequencing of two novel aspartic proteinases of fresh flowers of Cynara cardunculus L. Eur. J. Biochem. 235, 762–768.   Pdf
Vieira et al (2001) Molecular cloning and characterization of cDNA encoding cardosin B, an aspartic proteinase accumulating extracellularly in the transmitting tissue of Cynara cardunculus L. Plant Molecular Biology 45, 529–539.   Pdf

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